Curso de postgrado: “De la Mesada al Citómetro. Optimización de la inmunocitometría Multicolorimétrica y Cell sorting”

6 al 10 de mayo de 2019.

Organiza: INIGEM y la Facultad de Farmacia y Bioquímica (UBA).

Inscripción: a partir del 6 de abril

Lugar: INIGEM, 4to piso del Hospital de Clínicas José de San Martín. Av. Córdoba 2351, CABA

Director: Prof. Dr. Héctor Targovnik

Colaborador: Lic. Soledad Collado

Docentes: Bioq. Luis Ariel Billordo  /  Farm y Bioq. Plácida Baz

Carga Horaria: 24 horas reloj total, distribuido en 2 clases de 5 horas, 2 clases de 4 hs y 1 clase de 6hs. Las mismas serán repartidas en 15 horas la parte teórica y 9 horas la parte práctica. Los días de dictado de clases serán durante una semana de lunes a viernes en horarios a confirmar.

Procedimientos de evaluación:Examen final escrito individual (Vía online): Se evaluarán 12 casos problemáticos. La aprobación del examen debe tener 9 casos resueltos correctamente. Los requisitos de aprobación del curso serán una asistencia mínima del 80 % (5 clases) y aprobación del examen final.

Para consultas escribir a: [email protected]  /  [email protected]  /  [email protected]

1) Programa analítico :

Unidad 1): Reglas para optimizar la elección de fluoróforos en una combinación multicolorimétrica. (Parte Teórica) (Duración: 2 1/2 horas)
1a. Definición de inmunocitometria multicolorimetrica.
1b. Configuración óptica del citómetro de flujo, su influencia en la sensibilidad de resolución.
1c. Indice de tinción del fluorocrómo: concepto y aplicación.
1d. Nivel de expresión de la proteína blanco y su relación con dichas reglas.
1e. Sensibilidad de resolución y poblaciones brillantes.3
1f. Fluorocromos en tándem y sus limitaciones.
1g.Superposición espectral en la emisión de fluorescencia. Su influencia en la resolución de poblaciones.
Casos Problemas: Se evalúan distintas muestras; Biopsia endometrial humana, células mononucleares totales de sangre periférica humana, ganglio linfático de  rata en las cuáles se valora la sensibilidad de resolución frente a distintos esquemas de combinación de fluoróforos. (Duración: 1 1/2 horas)

Docente a cargo: Bioq. Luis Ariel Billordo

Unidad 2): Controles en la citometría de flujo: (Parte Teórica). (duración: 2 horas)
2a.Controles negativos en inmunofluorescencia directa e indirecta, con anticuerpos monoclonales y policlonales.
2b.Autofluorescencia,FMO, controles isotípicos, controles isoclónicos.
2c.Controles de compensación.
2d.Controles positivos. (control de desempeño del ensayo).
Casos Problemas: Buenas prácticas del uso del control isotípico en muestra de células mononuclares totales de sangre periférica. (Duración: 1 hora)
Docente a cargo: Bioq. y Farm. Plácida Baz

Unidad 3): Artefactos citométricos: (Parte Teórica) (duración: 2 horas)
3a.Agregados celulares: dobletes, tripletes. Detritos.
3b.Células muertas: su influencia. Exclusión de las mismas.
3c.Corrimientos inespecíficos del tubo de reacción respecto a sus controles negativos.
3d.Unión no deseada de los anticuerpos (principalmente vía Fc-RFc).
Casos Problemas: Exclusión de células apoptóticas por niveles de autofluorescencia y por tinción con sondas de viabilidad resistentes a la  fijación/permeabilización. Exclusión de agregados celulares en forma analítica (gráficos de puntos de FSC-A vs FSC-W, SSC-A vs SSC-W, FSC-H vs FSC-A).Buenas prácticas del uso de control isotípico, consecuencias de su uso incorrecto en una muestra de mononucleares totales derivada de sangre periférica humana. Bloqueo de RFc con CD16/CD32 en muestra de tumor mamario para inhibir la unión inespecífica de anticuerpos monoclonales a células mieloides infiltrantes. (Duración: 1 hora)

Docente a cargo: Bioq.y Farm. Plácida Baz.

Unidad 4): Inmunomarcación de fosfoproteínas (vías de señalización): (Parte Teórica) (duración: 2 1/2 horas)
4a.Comparación entre las distintas estrategias de detección de fosfoepitópes.
4b.Factores experimentales influyentes en los resultados.
4c.Métodos secuenciales y No secuenciales de inmunomarcación.
4d.Protocolos y reactivos comerciales de permeabilización/Fijación.
4e.Marcadores de superficie celular humanos/murinos validados para inmunoanálisis de fosfoproteínas.
Casos Problemas: Simulación de los pasos a evaluar para la inmunomarcación de pStat1 (pY701), CD4 y CD56 con la utilización de la base de datos Cytobank
(www.Cytobank.org) y la elección del protocolo más adecuado para ésta combinación. (Duración: 1 1/2 horas)

Docente a cargo: Bioq. Luis Ariel Billordo

Unidad 5): Interpretación y análisis de datos: (Parte Teórica) (duración: 3 horas)
5a.Validación interpretativa holística de los datos citométricos.
5b.Validación de la compensación.
5c.Número de eventos adquiridos; un abordaje estadístico.
5d.Métodos de análisis de datos: manual y automatizado.
Casos Problemas: Compensación y validación de la misma en una muestra de lavado hepático con una combinación de 7 colores. Infiltrado linfocitario en músculo cardíaco, la subjetividad del citometrísta en la compensación.3 Técnicas de análisis en una muestra de espermatozoides humanos en un ensayo de Tunel, su comparación de desempeño analítico. La importancia de la multiparametría para la identificación de LTreg en una muestra de ganglio linfático de rata. Uso de cuadrantes ortogonales en el análisis de muestras, sus limitaciones. (Duración: 2 horas)

Docente a cargo: Bioq. Luis Ariel Billordo

Unidad 6): Separación celular por Citometría de Flujo (Parte teórica) (duración:3 horas)
6a.Comparación entre los distintos métodos de Separación de Flujo- Mecánico y Deflección electroestática.
6b.Separación de Flujo aséptico y no aséptico.
6c.Desempeño de la separación celular de flujo por deflección electroestática: Rendimiento, Recuperación, eficiencia y Pureza.
6d. Puesta a punto de la separación celular de Flujo electroestático: Factores afectantes del desempeño de la separación celular; consideraciones de la citometría analítica, cálculo de Drop-delay, tamaño del nozzle, temperatura de la mezcla celular, umbral de lectura, modos de precisión del sorting, tipo celular, etc.
Casos problemas: Estimación del número de células por muestra a separar de acuerdo al número de células purificadas requeridas, concentración celular  requerida, estimación del tiempo de procesamiento. Discusión de diferentes muestras separadas para interpretar el cálculo de Rendimiento, Recuperación y pureza. Discusión de casos problemáticos; poblaciones poco frecuentes, células adherentes, etc.
(Duración: 2 horas)

Docente a cargo: Bioq. Luis Ariel Billordo y Bioq.Farm Plácida Baz.

2) Características metodológicas:

Curso teórico con práctico, en el cual cada clase constará de 2 partes:
En la primera de ellas el docente hará una introducción teórica del tema, con un ejemplo del caso-problema y posterior discusión con el alumnado. La  presentación será de tipo expositiva en un formato Power Point con ayuda del pizarrón en caso necesario. En la segunda parte se les brindarán a los alumnos casos problemáticos a resolver relacionados a la unidad temática correspondiente, ésta actividad será realizada en grupos de 5 alumnos cada uno. Una vez  resueltos los casos, su solución será expuesta al resto de la clase para ser discutida y analizada con el docente.

3) Recursos didácticos:

Diapositivas de Power Point. Publicaciones científicas (Papers) en formato digital (pdf). Software de análisis citométrico (Flow Jo, Cell Quest, etc).

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